如何评估共聚焦光学截面厚度

一、控制光学切片厚度的参数
在理想条件下，可实现的最薄切片厚度仅取决于光学衍射的限制。
影响最 大的是波长，主要按比例控制PSF的大小：波长越短，切片越薄。我们可以假设激发光的波长有限（而不是发射光的波长），因为照明区域外并无发射光。

第二个参数是物镜的光圈（数值孔径，NA）：NA越高（信息收集的角度越宽），则光学切片越薄。此外，样本的折射率会影响轴向分辨率，进而影响到切片性能。

第三个参数是探测路径中的针孔直径，对于上面给出的公式可假设其为零。因此，该公式给出了荧光成像的最 佳值，当然这只具有理论意义：直径为零的针孔不会生成明亮的图像。

二、学切片厚度的评估关键
数值孔径NA对切片厚度有显著影响。PSF的径向扩展与NA成线性关系。因此，对于低NA物镜，PSF内核会拉得极长，而且切片会变得很厚。因此，绝大多数应用中都是用NA>1的浸润式物镜，其中xy和z维度的比例大致接近于2倍。按照经验，高NA物镜z部分分辨率大致为xy的两倍。

理论上的考虑有助于评估光学系统的性能。实际上，仪器和样本都会导致计算数值的偏差。必须仔细校准并操作仪器才能获得最 佳性能。

因此，必须特别注意折射率匹配、适宜和恒定的温度以及正确的盖玻片选择。该理论给出的是经验法则，但样本和设置可能会带来显著的偏差——因为生物样本比晶体（或真空）更复杂，所以偏差通常也不可避免。