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共聚焦显微镜的使用方法

发布日期:2022-02-11 发布人员: 浏览次数:1087

       共聚焦显微镜与传统显微镜相比,具有高分辨率、高灵敏度、高放大率等特点。随着软件开发和应用技术的完善,共聚焦显微镜已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。

共聚焦显微镜的样品制备

  共聚焦显微镜样品制备是检测前的关键步骤。样品需经荧光探剂标记(单标、双标、三标)。

  标本可以是固定的或活的组织,也可以是固定的或活的贴壁培养,细胞应培养在Confocal专用小培养皿或盖玻片上,悬浮细胞,甩片或滴片后,用盖玻片封片。样品的Zda厚度约1~2mm,使用的盖玻片厚度应小于0.17mm,载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间,而且表面光洁,厚度均匀,没有明显的干扰荧光。固定样品常用封片剂进行封片,常用PH8.5-9的PBS配制的甘油封片。


  常规样品制备要求:

  1、染料的选择

  由于共聚焦显微镜是以单一波长的激光作为光源,因此在选择荧光染料时要根据共聚焦显微镜配备的激光器波长选择,如果在同一样品中有多种荧光染料标记,还要考虑它们的发射波长尽量不要重叠,避免串色问题。

  2、样品承载物的选择

  一般的共聚焦显微镜高倍物镜均为油镜,它的数值孔径较小,要求镜头与样品之间的工作距离不大于0.17mm,因此如果观察样品为贴壁细胞或组织切片,可以用普通的载玻片和盖玻片即可。如果是悬浮细胞或悬浮粒子,可以用共聚焦显微镜专用的培养皿承载样品进行观察。

  3、封片剂的选择

  如果样品只需要观测一次并且不是极易淬灭的荧光,可以选用一定浓度的甘油混合液封片即可。如果样品需要放置一段时间并多次拍摄,应选用抗荧光淬灭的封片剂,以减少荧光信号丢失。

共聚焦显微镜的操作步骤

  ①根据荧光探针的激发波长和发射波长,选择合适的激光器、激光功率,分光镜滤片和发射滤片。

  ②确定扫描方式:点、线、面、三维扫描。

  ③确定扫描密度(分辨率):256×256、512×512、1024×1024、2048×2048,分辨率越高,扫描速度越慢,图像信噪比越好,但也越容易发生光漂白。

  ④选取共聚焦显微镜物镜的倍数及电子放大倍数:这个条件被确定后,扫描范围即被确定,物镜的光透射率与数值孔径(NA)的4次方成正比,与物镜的放大倍数的平方成反比,因此,应尽量选择高数值孔径的物镜。

  ⑤根据样品的制备质量选择合适的针孔大小,调整激光管电压、光电倍增管功率、降噪等至Z佳状态,这些参数选择或设置有非常密切的关系,选择时应综合考虑。

  ⑥确定光切范围,即扫描样品的厚度,锁定起始位置和结束位置。

  ⑦给出光切的层数及取图时累计平均次数。

  ⑧获取图像并保存。



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