共聚焦显微镜的使用方法

       共聚焦显微镜与传统显微镜相比，具有高分辨率、高灵敏度、高放大率等特点。随着软件开发和应用技术的完善，共聚焦显微镜已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。

共聚焦显微镜的样品制备

　　共聚焦显微镜样品制备是检测前的关键步骤。样品需经荧光探剂标记(单标、双标、三标)。

　　标本可以是固定的或活的组织，也可以是固定的或活的贴壁培养，细胞应培养在Confocal专用小培养皿或盖玻片上，悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封片。样品的Zda厚度约1~2mm，使用的盖玻片厚度应小于0.17mm，载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间，而且表面光洁，厚度均匀，没有明显的干扰荧光。固定样品常用封片剂进行封片，常用PH8.5-9的PBS配制的甘油封片。

　　常规样品制备要求：

　　1、染料的选择

　　由于共聚焦显微镜是以单一波长的激光作为光源，因此在选择荧光染料时要根据共聚焦显微镜配备的激光器波长选择，如果在同一样品中有多种荧光染料标记，还要考虑它们的发射波长尽量不要重叠，避免串色问题。

　　2、样品承载物的选择

　　一般的共聚焦显微镜高倍物镜均为油镜，它的数值孔径较小，要求镜头与样品之间的工作距离不大于0.17mm，因此如果观察样品为贴壁细胞或组织切片，可以用普通的载玻片和盖玻片即可。如果是悬浮细胞或悬浮粒子，可以用共聚焦显微镜专用的培养皿承载样品进行观察。

　　3、封片剂的选择

　　如果样品只需要观测一次并且不是极易淬灭的荧光，可以选用一定浓度的甘油混合液封片即可。如果样品需要放置一段时间并多次拍摄，应选用抗荧光淬灭的封片剂，以减少荧光信号丢失。

共聚焦显微镜的操作步骤

　　①根据荧光探针的激发波长和发射波长，选择合适的激光器、激光功率，分光镜滤片和发射滤片。

　　②确定扫描方式：点、线、面、三维扫描。

　　③确定扫描密度(分辨率):256×256、512×512、1024×1024、2048×2048，分辨率越高，扫描速度越慢，图像信噪比越好，但也越容易发生光漂白。

　　④选取共聚焦显微镜物镜的倍数及电子放大倍数:这个条件被确定后，扫描范围即被确定，物镜的光透射率与数值孔径(NA)的4次方成正比，与物镜的放大倍数的平方成反比，因此，应尽量选择高数值孔径的物镜。

　　⑤根据样品的制备质量选择合适的针孔大小，调整激光管电压、光电倍增管功率、降噪等至Z佳状态，这些参数选择或设置有非常密切的关系，选择时应综合考虑。

　　⑥确定光切范围，即扫描样品的厚度，锁定起始位置和结束位置。

　　⑦给出光切的层数及取图时累计平均次数。

　　⑧获取图像并保存。