徕卡共聚焦课堂第三讲：光路篇

通过照亮和观察单个衍射极限点，在激光共焦系统中实现光学切片。这需要两个光束段焦点一致，因此是“共焦的”。与宽场成像不同，共聚焦图像没有散焦模糊情况。这本身就是一个优势，因为样品深层的图像显示清晰，细节丰富。然而，最重要的优势是其具有微观特征的三维可视化潜力。沿三维（z-stack）采集图像序列后，由计算机重建和显示三维物体。

共焦照明

通过将光源聚焦在小孔径（针孔）上，然后聚焦到样品中，实现点光源照明。当孔径足够小时，照明点仅受衍射限制，不受光源和孔径几何参数的限制。普通光源是大的面光源，是不可能将其聚焦到衍射极限的光点上。因此，尽管透过率非常低，这种聚焦照明光仍然是十分必要的（对于传统光源）。

图1：用于共焦成像的照明。来自光源（Ls）的光聚焦于照明针孔（Pi），然后进入样品S。

激光作为光源具有非常高的准直度（优质激光器提供的光“极度平行”）。因此，在不应用针孔的情况下，激光可以通过单个透镜聚焦到衍射极限的光点上。因此，大多数共聚焦显微镜没有照明针孔。光点的质量取决于激光的光束质量。如果质量不佳，也可以插入照明针孔。激光通常通过光纤耦合到共聚焦显微镜上。这些光纤本身也起针孔的作用。

激光的可聚焦性和高能量密度使其成为共聚焦显微镜的理想光源。激光的相干性不是共焦性能所需的特征。相反，这对光学设计师来说是一个挑战，因为它会引起假的干扰图案，因而需要谨慎的设计策略。

此外，传统激光器仅发射单一颜色（激光-“谱线”），这一事实本身也有局限，在多荧光成像和测量时，就需要复杂的多激光排列。白激光很巧妙地解决了多色成像的问题。

图2：共焦（右侧区域）和非共焦成像的比较。在Feulgen染色的小鼠滋养层中。非共焦图像的很多信息并非来自焦平面。共焦光学消除了所有模糊的因素，使结构变得清晰。

共聚焦检测

大多数探测器具有相当大的敏感区域（光电倍增管通常为几平方厘米）。共焦光学器件需要点状探测。因此，必须通过在光束中插入一个小孔径（针孔）来执行光点检测。将样品的光聚焦到该针孔上，收集并记录透射光。

由于衍射模式取决于数值孔径和波长，所以必须进行针孔检测。因此当这些参数改变时，必须调整针孔尺寸。

当物镜改变时（通常数值孔径也会随之改变），现代的共焦扫描显微镜会自动适当地改变针孔直径。因此，针孔通常设计为双层或多层光圈。

实际上，针孔的合适尺寸不仅取决于波长和数值孔径，还取决于显微镜中光学元件的内部放大倍数。

因此，在设计不同的显微镜中直接比较针孔直径不仅不可取，也是错误的。如果针孔直径未设置为最 佳值，系统将无法顺利进行光学切片（即传输散焦模糊），或者在没有获得进一步的光学切片质量的情况下不必要地阻断信号（导致不必要的噪声图像）。

图3：共聚焦成像中的检测。来自样品S的光聚焦于观察针孔（Po），随后聚焦到检测器De上。

共焦扫描的光路

共焦扫描系统中的共聚焦光束路径只是点光源照明和点探测的结合。这种组合可起到光学切片的效果。只有来自焦平面的光子才能传递到传感器。而来自其他地方的所有光子都被滤除。通过“空间滤波器”的方式实现光学切片。

由于在给定时间内，只有一个光点出现“共聚焦”成像，因此需要一个扫描设备以栅格模式在物场上移动该光点。通常情况下，光学镜安装在扫描电机上，用于执行扫描程序。在扫描全帧（通常）1,024行所需的时间方面遇到了瓶颈。通过引入每秒扫描8,000或更多行的高速扫描仪（共振扫描仪），实现了改进。

只有在反射光显微技术下才能实现良好的光学切片。这是近20年荧光显微技术蓬勃发展的原因之一（其他原因还包括免疫染色、DNA-杂交、荧光生物传感器、量子点和荧光蛋白的发明）。

图4：从左至右：1. 照明锥不仅在焦平面内激发荧光染料，在其上下都会激发。此处用绿色双锥体表示。2. 发射针孔有效地截断从焦平面上方发出的光。3. 此外，来自焦平面下方的光也不会通过针孔。4. 在共聚焦系统中，只有来自样品焦平面的光才会到达检测器。检测针孔会有效拒绝来自其他区域的任何光。最 终得到真正的光学切面。